Come Eseguire un'Analisi Spettrofotometrica

Co-redatto da Meredith Juncker, PhD

La spettroscopia è una tecnica sperimentale che si utilizza per misurare la concentrazione dei soluti in una soluzione specifica calcolando la quantità di luce assorbita dai soluti stessi.^{[1]
X
Fonte di ricerca} Si tratta di una procedura molto efficace perché certi composti assorbono diverse lunghezze d'onda della luce a intensità differenti. Analizzando lo spettro che attraversa la soluzione, puoi riconoscere le specifiche sostanze disciolte e la loro concentrazione. Lo spettrofotometro è lo strumento che viene utilizzato in un laboratorio di ricerca chimica per l'analisi delle soluzioni.

Parte 1

Parte 1 di 3:

Preparare i Campioni

1
Accendi lo spettrofotometro. La maggior parte di questi dispositivi deve scaldarsi prima di poter fornire delle letture precise. Avvialo e lascia che si prepari per almeno 15 minuti prima di inserirvi le soluzioni.^{[2]
X
Fonte di ricerca}
- Sfrutta questo tempo per preparare i campioni.
2
Pulisci le provette o le cuvette. Se stai eseguendo un esperimento di laboratorio per la scuola, potresti avere a disposizione del materiale monouso che non deve essere pulito; se invece stai utilizzando dei materiali riutilizzabili, assicurati che siano perfettamente lavati prima di procedere. Risciacqua accuratamente ogni cuvetta con acqua deionizzata.
- Fai attenzione mentre maneggi questo materiale perché è piuttosto costoso, soprattutto se in vetro o quarzo. Le cuvette di quarzo sono progettate per l'uso nella spettrofotometria UV-visibile.
- Quando utilizzi la cuvetta, evita di toccare i bordi in cui passerà la luce (in genere il lato trasparente del recipiente).^{[3]
  X
  Fonte di ricerca} Se li tocchi accidentalmente, pulisci la cuvetta con un panno appositamente ideato per la pulizia di strumenti da laboratorio, in modo da evitare di graffiare il vetro.
3
Trasferisci la quantità appropriata di soluzione nel recipiente. Alcune cuvette possono contenere al massimo 1 ml di liquido, mentre le provette hanno in genere una capienza di 5 ml. Fintanto che il fascio di luce laser attraversa il liquido e non lo spazio vuoto del contenitore, puoi ottenere dei risultati precisi.
- Se utilizzi una pipetta per trasferire la soluzione nel recipiente, ricorda di usare una punta nuova per ogni campione per evitare la contaminazione crociata.^{[4]
  X
  Fonte di ricerca}
4
Prepara la soluzione di controllo. È nota anche come bianco analitico (o semplicemente bianco) ed è costituita dal solvente puro della soluzione analizzata; per esempio, se il campione è composto da sale disciolto in acqua, il bianco è rappresentato dalla sola acqua. Se hai tinto l'acqua di rosso, anche il bianco deve essere acqua rossa; inoltre, il campione di controllo deve avere il medesimo volume ed essere conservato in un recipiente identico a quello soggetto alle analisi.^{[5]
X
Fonte di ricerca}
5
Asciuga la parte esterna della cuvetta. Prima di metterla nello spettrofotometro, assicurati che sia quanto più pulita possibile per evitare che le particelle di sporcizia creino interferenze. Usa un panno che non lasci lanugine, asciuga le gocce d'acqua e togli la polvere che potrebbe essersi accumulata sulle pareti esterne.^{[6]
X
Fonte di ricerca}

Pubblicità

Parte 2

Parte 2 di 3:

Eseguire l'Esperimento

1
Scegli una lunghezza d'onda con cui analizzare il campione e imposta il dispositivo di conseguenza. Opta per una luce monocromatica (con una sola lunghezza d'onda) per procedere con un'analisi più efficace. Dovresti scegliere un colore di luce che sai per certo che possa essere assorbito da una delle sostanze chimiche che ritieni ci siano nella soluzione; prepara lo spettrofotometro seguendo le istruzioni specifiche del modello in tuo possesso.^{[7]
X
Fonte di ricerca}
- In genere, durante le lezioni di laboratorio a scuola l'enunciato del problema o l'insegnante forniscono le informazioni in merito alla lunghezza d'onda da usare.
- Dato che il campione riflette sempre tutta la luce del proprio colore, devi scegliere una lunghezza d'onda diversa rispetto a quella del colore della soluzione.
- Gli oggetti appaiono di un determinato colore perché riflettono delle particolari lunghezze d'onda della luce e assorbono tutte le altre; l'erba è verde perché la clorofilla in essa contenuta riflette tutta la luce verde e assorbe il resto.^{[8]
  X
  Fonte di ricerca}
2
Calibra il macchinario con il bianco. Metti la soluzione di controllo nell'alloggiamento della cuvetta e chiudi il coperchio. Se stai usando uno spettrofotometro analogico, dovresti vedere una scala graduata su cui si muove un ago in base all'intensità della luce che viene rilevata. Quando il bianco si trova nello strumento, dovresti notare che l'ago si sposta completamente verso destra; annota il valore indicato nel caso ti servisse in seguito; senza togliere la soluzione di controllo, riporta l'indicatore sullo zero usando l'apposito pomello di regolazione.
- I modelli digitali possono essere calibrati nello stesso modo, ma dovrebbero avere un display digitale; imposta il bianco a zero usando il pomolo di regolazione.
- Quando togli la soluzione di controllo, la calibratura non si perde; mentre misuri il resto dei campioni, la macchina sottrae automaticamente l'assorbimento del bianco.
- Assicurati di utilizzare un singolo bianco per sessione in modo che ogni campione sia calibrato sullo stesso bianco. Per esempio, se dopo aver calibrato lo spettrofotometro con il bianco analizzassi solo una parte dei campioni e poi lo calibrassi di nuovo, l'analisi dei campioni rimanenti sarebbe imprecisa e dovresti ricominciare da capo.
3
Estrai la cuvetta con il bianco analitico e verifica la calibratura. L'ago dovrebbe rimanere sullo zero della scala graduata oppure il display digitale dovrebbe continuare a mostrare il numero "0". Inserisci nuovamente la soluzione di controllo e verifica che la lettura non cambi; se lo spettrofotometro è ben regolato, non dovresti notare alcuna variazione.
- Se l'ago o il display indicano un numero diverso da quello nullo, ripeti la procedura descritta in precedenza con il bianco.
- Se continui ad avere problemi, chiedi aiuto o fai controllare il dispositivo da un tecnico.
4
Misura l'assorbanza del campione. Rimuovi il bianco e inserisci la cuvetta con la soluzione nella macchina facendola scorrere nell'apposito incavo e assicurandoti che sia in posizione verticale; aspetta circa 10 secondi finché l'ago non è fermo o finché i numeri non smettono di cambiare. Annota i valori percentuali di trasmittanza o di assorbanza.
- L'assorbanza è anche nota come "densità ottica" (OD).
- Maggiore è la luce trasmessa e minore è la porzione assorbita dal campione; in linea generale, devi annotare i dati dell'assorbanza che vengono espressi in numeri decimali, ad esempio 0,43.
- Se ottieni un risultato anomalo (per esempio 0,900 quando il resto è intorno a 0,400), diluisci il campione e misura nuovamente l'assorbanza.
- Ripeti la lettura almeno tre volte per ogni campione che hai preparato e calcolane la media; in questo modo, sei certo di ottenere risultati precisi.
5
Ripeti il test con le lunghezze d'onda successive.^{[9]
X
Fonte di ricerca} Il campione potrebbe avere diverse sostanze sconosciute disciolte nel solvente, la cui capacità di assorbimento della luce dipende dalla lunghezza d'onda. Per eliminare tale incertezza, ripeti le letture variando la lunghezza d'onda di 25 nm alla volta; così facendo, puoi riconoscere gli altri elementi chimici sospesi nel liquido.

Pubblicità

Parte 3

Parte 3 di 3:

Analizzare i Dati dell'Assorbanza

1
Calcola la trasmittanza e l'assorbanza del campione. La trasmittanza indica la quantità di luce che ha attraversato la soluzione e ha raggiunto il sensore dello spettrofotometro. L'assorbanza è la quantità di luce che è stata assorbita da uno dei composti chimici presenti nel solvente. Molti degli spettrofotometri moderni forniscono i dati di queste grandezze, ma se hai annotato l'intensità, devi calcolarli.^{[10]
X
Fonte di ricerca}
- La trasmittanza (T) si rileva dividendo l'intensità di luce che ha attraversato il campione per quella della luce che ha attraversato il bianco e si esprime in genere come un numero decimale o percentuale. T = I/I₀, dove I è l'intensità relativa al campione e I₀ quella riferita al bianco analitico.
- L'assorbanza (A) si esprime con il negativo del logaritmo in base 10 del valore della trasmittanza: A = -log₁₀T.^{[11]
  X
  Fonte di ricerca} Se T=0,1 il valore di A è pari a 1 (dato che 0,1 è 10^-1), il che significa che il 10% della luce è stato trasmesso e il 90% assorbito. Se T=0,01, A=2 (dato che 0,01 è 10^-2); di conseguenza, è stato trasmesso l'1% della luce.
2
Riporta i valori dell'assorbanza e delle lunghezze d'onda in un grafico. Indica i primi sull'asse delle ordinate e le lunghezze d'onda su quello delle ascisse. Inserendo i valori dell'assorbenza massima per ogni lunghezza d'onda utilizzata, ottieni il grafico dello spettro di assorbimento del campione;^{[12]
X
Fonte di ricerca} puoi quindi identificare i composti radunando le sostanze presenti e le loro concentrazioni.
- Uno spettro di assorbimento presenta in genere dei picchi a determinate lunghezze d'onda che permettono di riconoscere i composti specifici.
3
Confronta il grafico del campione con quelli noti per determinate sostanze. I composti presentano uno spettro di assorbimento individuale e producono sempre un picco alla stessa lunghezza d'onda ogni volta che vengono testati; dal confronto puoi riconoscere i soluti presenti nel liquido.
- Puoi sfruttare questo metodo per riconoscere i contaminanti presenti nel campione. Se ti aspetti un picco evidente a una determinata lunghezza d'onda, ma ne ottieni due in corrispondenza di altri valori di "x", sei certo che c'è qualche anomalia nel campione.
Pubblicità

Cose che ti Serviranno

Spettrofotometro
Soluzione di una sostanza da analizzare
Solvente in più (per il bianco analitico)
Contenitori per il test e per i bianchi analitici (cuvette, provette e via dicendo)